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PCR, Elettroforesi, Southern blot, Northern blot, Western blot
PCR: La reazione a catena della polimerasi o PCR è una tecnica estremamente versatile per copiare il DNA. In breve, la PCR consente, attraverso una reazione enzimatica condotta mediante polimerasi termostabile, di copiare milioni di volte un frammento di DNA. Particolari usi di questa metodica consentono anche l'alterazione in un modo predeterminato di una sequenza di DNA. Ad esempio, la PCR può essere usata per introdurre siti di restrizione o mutare particolari basi azotate della sequenza del DNA. La PCR, in generale, può essere utilizzata per diversi scopi, sia per ricerca che diagnostica.
Elettroforesi a gel: L'elettroforesi su gel è una delle metodologie principali della biologia molecolare. Il principio base sta nella possibilità di separare DNA, RNA e proteine sfruttando un campo elettrico. Con l'elettroforesi su gel di agarosio, si possono separare acidi nucleici in base alle dimensioni. Le proteine possono essere separate in base alle dimensioni o in base alla carica elettrica (in quest'ultimo caso si parla di gel isoelettrico) usando un gel di poliacrilammide (eventualmente in presenza di sodio dodecilsolfato).
Southern blot: Questo metodo serve a sondare la presenza di specifiche sequenze di DNA in un campione di DNA: i campioni, prima e dopo una digestione con enzimi di restrizione sono separati tramite elettroforesi su gel e dunque trasferiti su una membrana sfruttando la capillarità. La membrana può dunque essere indagata usando una sonda di DNA marcata complementare alla sequenza di interesse (i protocolli originariamente prevedevano marcatura con isotopi radioattivi, ora sono disponibili marcature non radioattive). Il Southern blot è una tecnica ora meno usata, considerata la capacità della PCR di individuare specifiche sequenze di DNA da un campione, ma il Southern blot può essere usato per altre applicazioni, quali la conta del numero di copie di un transgene in un topo transgenico o l'ingegnerizzazione di geni knockout in linee di cellule staminali embrionali.
Northern blot: Il northern blot è usato per studiare l'espressione di specifiche molecole di RNA da specifici campioni in comparazioni relative. Sostanzialmente è una combinazione di elettroforesi su gel di RNA denaturato e di un blotting. In questo processo, l'RNA è separato in base alle dimensioni ed è poi trasferito ad una membrana che viene sondata con una sequenza complementare marcata alla sequenza di interesse. I risultati possono essere visualizzati in modi diversi a seconda della marcatura utilizzata: in generale, si rivelano bande la cui intensità è correlata alla quantità dell'RNA di interesse nel campione indagato. La procedura è comunemente usata per studiare quando e quanto il gene viene espresso.
Western blot: Sono stati sintetizzati anticorpi contro molte proteine iniettando una piccola quantità della proteina in un animale quale topo, coniglio, pecora o asino (anticorpi policlonali). Questi anticorpi possono essere usati per diverse tecniche analitiche o preparative. Nel Western blot le proteine sono separate in base alle dimensioni tramite SDS-PAGE e trasferite su una membrana di supporto, generalmente di nitrocellulosa o nylon. La membrana può essere sondata con soluzioni di anticorpi. Gli anticorpi che legano specificamente la proteina di interesse possono essere visualizzate con tecniche diverse, tra cui prodotti colorati, chemioluminescenza o autoradiografia. Metodi analoghi al Western blot possono essere usati per colorare specifiche proteine in sezioni di tessuto o in cellule. Queste tecniche (si parla di immunostaining sono tipicamente utilizzate in biologia cellulare. I termini "Western" e "Northern" sono frutto di un gioco di parole: i primi blots erano effettuati con il DNA ed erano noti come "Southerns" in onore al loro inventore, Ed Southern. Il blot seguente, inventato da Patricia Thomas, divenne noto come "Northern". Per portare avanti il gioco di parole, si possono trovare riferimenti in letteratura a "Southwestern blots" (che indagano le interazioni proteina-DNA) e "Farwestern blots" (per interazioni proteina-proteina).
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